一,基本原理
二,應用範圍
三,儀(yi) 器結構


一,基本原理
利用紫外－可見吸收光譜來進行定量分析由來已久，可追溯到古代，公元60年古希臘已經知道利用五味子浸液來估計醋中鐵的含量，這一古老的方法由於(yu) zui初是運用人眼來進行檢測，所以又稱比色法。到了16、17世紀，相關(guan) 分析理論開始蓬勃發展，1852年，比爾（Beer）參考了布給爾（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所發表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與(yu) 呈色溶液的濃度成比例，從(cong) 而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是的朗伯－比爾定律。
1．紫外－可見吸收光譜的形成
吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指儀(yi) 器的功能，即儀(yi) 器進行分光並用光度法測定，這類儀(yi) 器包括了分光光度計與(yu) 原子吸收光譜儀(yi) （AAS）。吸光光度法的本質是光的吸收，因此稱吸光光度法比較合理，當然，稱分子吸光光度法是zui確切的。
紫外－可見吸收光譜是物質中分子吸收200-800nm光譜區內(nei) 的光而產(chan) 生的。這種分子吸收光譜產(chan) 生於(yu) 價(jia) 電子和分子軌道上的電子在電子能級躍遷（原子或分子中的電子，總是處在某一種運動狀態之中。每一種狀態都具有一定的能量，屬於(yu) 一定的能級。這些電子由於(yu) 各種原因（如受光、熱、電的激發）而從(cong) 一個(ge) 能級轉到另一個(ge) 能級，稱為(wei) 躍遷。）當這些電子吸收了外來輻射的能量就從(cong) 一個(ge) 能量較低的能級躍遷到一個(ge) 能量較高的能級。因此，每一躍遷都對應著吸收一定的能量輻射。具有不同分子結構的各種物質，有對電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基於(yu) 這種物質對電磁輻射的選擇性吸收的特性而建立起來的，它屬於(yu) 分子吸收光譜。躍遷所吸收的能量符合波爾條件：

二,應用範圍
紫外－可見分光光度計可用於(yu) 物質的定量分析、結構分析和定量分析。而且還能測定某些化合物的物理化學參數，如摩爾質量、配合物的配合比例和穩定常熟、酸堿電離常數等。
1．定性分析
緊外－可見分光光度法對無機元素的定性分析應用較少，無機元素的定性分析可用原子發射光譜法或化學分析的方法。在有機化合物的定性鑒定和結構分析中，由於(yu) 紫外－可見光譜較簡單，特征性不強，因此該法的應用也有一定的局限性。但是它適用於(yu) 不飽和有機化合物。尤其是共軛體(ti) 係的鑒定，以此推斷未知物的骨架結構。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質譜法進行定性鑒定和結構分析，因此它仍不失為(wei) 是一種有用的輔助方法。
一般有兩(liang) 種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經驗規則計算zui大吸收波長λmax，然後與(yu) 實測值進行比較。
2．結構分析
結構分析可用來確定化合物的構型和構象。如辨別順反異構體(ti) 和互變異構體(ti) 。
3．定量分析
紫外－可見分光光度定量分析的依據是Lambert-Beer定律，即在一定波長處被測定物質的吸光度與(yu) 它的溶度呈線性關(guan) 係。應此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度可求出該物質在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有：單組分定量法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導數光譜法等。
4．配合物組成及其穩定常數的測定
測量配合物組成的常用方法有兩(liang) 種：摩爾比法（又稱飽和法）和等摩爾連續變化法（又稱Job法）。
5．酸堿離解常數的測定
光度法是測定分析化學中應用的指示劑或顯色劑離解常數的常用方法，該法特別適用於(yu) 溶解度較小的弱酸或弱堿。

三,儀(yi) 器結構
1.紫外－可見分光光度計的主要部件

*的紫外－可見分光光度計生產(chan) 廠家有上百家，產(chan) 品型號成千上萬(wan) ，但就基本結構來說，都是由五個(ge) 部分組成，即光源、單色器（單色儀(yi) ）、吸收池、檢測器和信號指示係統。如下圖所示：


光源
對光源的基本要求是：應在儀(yi) 器操作所需的光譜區域內(nei) 能夠發射連續輻射；有足夠的輻射強度和良好的穩定性，而且輻射能量隨波長的變化應盡可能小。紫外－可見分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體(ti) 放電光源兩(liang) 類。熱輻射光源用於(yu) 可見光區。如鎢絲(si) 燈和鹵鎢燈；氣體(ti) 放電光掉用於(yu) 紫外光區，如氫燈和氘燈。
鎢燈和碘鎢燈可使用的範圍在340～2500nm，這類光源的輻射能量與(yu) 施加的外加電壓有關(guan) ，在可見光區，輻射的能量與(yu) 工作電壓的4 次方成正比。光電流也與(yu) 燈絲(si) 電壓的n次方（n>l）成正比。因此必須嚴(yan) 格控製燈絲(si) 電壓，儀(yi) 器必須備有穩壓裝置。
在近紫外區測定時常用氫燈和氘燈，它們(men) 可在160～375nm 範圍內(nei) 產(chan) 生連續光源。氘燈的燈管內(nei) 充有氫的同位素氘，它是紫外光區應用zui廣泛的一種光源，其光譜分布與(yu) 氫燈類似，但光強度比相同功率的氫燈要大3～5 倍。
單色器
單色器是能從(cong) 光源輻射的複合光中分出單色光的光學裝置，其主要功能應該是能夠產(chan) 生光譜純度高且波長在紫外可見區域內(nei) 任意可調的單色光。單色器一般由入射狹縫、準直鏡（透鏡或凹麵反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色教元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響人射光的單色性，從(cong) 而也影響到測定的靈敏度、選擇性及校準曲線的線性關(guan) 係等。
能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。棱鏡常用的材料有玻璃和石英兩(liang) 種。它們(men) 的色散原理是依據不同波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由於(yu) 玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡隻能用於(yu) 350～3200 nm 的波長範圍，即隻能用於(yu) 可見光區域內(nei) 。石英棱鏡適用的波長範圍較寬，可從(cong) 185～4000nm，即可用於(yu) 紫外、可見、近紅外三個(ge) 光域。
光柵是利用光的衍射與(yu) 幹涉原理製成的。它可用於(yu) 紫外、可見及近紅外光域，而且在整個(ge) 波長區具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長範圍寬、分辨本領高、成本低、便於(yu) 保存和易於(yu) 製備等優(you) 點。缺點是各級光譜會(hui) 重疊而產(chan) 生幹擾。
入射、出射狹縫，透鏡及準直鏡等光學元件中狹縫在決(jue) 定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會(hui) 減弱光強。
吸收池
吸收池用於(yu) 盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩(liang) 種。石英池適用於(yu) 可見光區及紫外光區，玻璃吸收池隻能用於(yu) 可見光區。為(wei) 減少光的反射損失，吸收池的光學麵必須*垂直於(yu) 光束方向．在高精度的分析測定中（紫外區尤其重要）,吸收池要挑選配對。因為(wei) 吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結果都有影響。
檢測器
檢測器的功能是檢測光信號、測量單色光透過溶液後光強度變化的一種裝置，常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。它們(men) 通過光電效應將照射到檢測器上的光信號轉變成電信號。對檢測器的要求是：在測定的光譜範圍內(nei) 具有高的靈敏度；對輻射能量的響應時間短，線性關(guan) 係好；對不同彼長的輻射響應均相同，且可靠；噪音低，穩定性好等。
硒光電池對光的敏感範圍為(wei) 300～800nm ，其中又以500～600nm zui為(wei) 靈敏。這種光電池的特點是能產(chan) 生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由於(yu) 容易出現疲勞效應而隻能用於(yu) 低檔的分光光度計中。
光電管在紫外－可見分光光度計上應用較為(wei) 廣泛。它的結構是以一彎成半圓柱形的金屬片為(wei) 陰極，陰極的內(nei) 表麵塗有光敏層，在圓柱形的中心置一金屬絲(si) 為(wei) 陽極．接受陰極釋放出的電子。兩(liang) 電極密封於(yu) 玻璃或石英管內(nei) 並抽成真空。陰極上光敏材料不同，光譜的靈敏區也不同。可分為(wei) 藍敏和紅敏兩(liang) 種光電管，前者是在鎳陰極表麵上沉積銻和豔，可用於(yu) 波長範困為(wei) 210～625 nm；後者是在陰極表麵上沉積了銀和氧化豔。可用範圍為(wei) 625～1000nm。與(yu) 光電池比較，它有靈敏度高、光敏範圍寬、不易疲勞等優(you) 點。
光電倍增管是檢測微弱光zui常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200 倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從(cong) 而對光譜的精細結構有較好的分辨能力。
信號指示係統
它的作用是放大信號並以適當方式指示或記錄下來。早期常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調節指零裝置以及數字顯示或自動紀錄裝置等。現在很多型號的分光光度計都可配套計算機使用，一方麵可對分光光度計進行操作控製，另一方麵可進行數據處埋。
2．紫外－可見分光光度計的分類


紫外－可見分光光度計的類型很多，但可歸納為(wei) 三種類型：單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。

單光束分光光度計
其光路示意圖如前圖（紫外－可見分光光度計的基本結構圖）所示，經單色器分光後的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶掖，以進行吸光度的測定。這種類型的分光光度計結構簡單，操作方便，維修容易，適用於(yu) 常規分析。國產(chan) 722型，751型、724型、英國SP500型以及Backman DU－8 型等均屬於(yu) 此類光度計。
雙光束分光光度計
其光路示意如下圖所示，經單色器分光後經反射鏡（M1）分解為(wei) 弧度相等的兩(liang) 束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩(liang) 束光的強度，此比值即為(wei) 試樣的透射比，經對數變換將它轉換成吸光度並作為(wei) 波長的函數記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由於(yu) 兩(liang) 束光同時分別通過參比池和樣品他，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。這類儀(yi) 器有國產(chan) 710 型、730型和740型，日立220係列，島津－210，英國UNICAM SP－700等等。




雙波長分光光度計
其基本光路如下圖所示。由同一光源發出的光被分成兩(liang) 束，分別經過兩(liang) 個(ge) 單色器，得到兩(liang) 束不同波長的單色光；再利用切光器使兩(liang) 束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然後經過光電倍增管和電子控製係統，zui後由顯示器顯示出兩(liang) 個(ge) 波長處的吸光度差值ΔA （ΔA = A1-A2）。
雙波長分光光度計的優(you) 點：對於(yu) 多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）的分析，以及存在背景於(yu) 擾或共存組分吸收幹擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導數光譜。通過光學係統轉換，使雙波長分光光度計能很方便地轉化為(wei) 單波長工作方式。如果能在兩(liang) 波長處分別記錄吸光度隨時間變化的曲線，還能進行化學反應動力學研究。